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糞便樣品處理與保存方式是否會影響微生物多樣性?

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在微生物多樣性研究中,樣品的處理與儲存條件對於分析微生物菌群有著重要的影響,尤其是進行人類腸道菌群研究時的樣品採集,由於往往無法採樣後立即進行人類糞便樣本的凍存處理或立即實驗分析,因此糞便樣品的保存方式及條件對於研究是相當重要的議題。

對於處理與保存的時間與方法的探討,在今年有兩篇文章做了深入的討論,分別是:

(A) 2016年7月30日發表在 Microbiome 的一篇論文:"Latitude in sample handling and storage for infant faecal microbiota studies: the elephant in the room?"

(B) 2016年5月26日發表在 Scientific Reports 的 "Effect of short-term room temperature storage on the microbial community in infant fecal samples"



讓我們就分別來介紹兩篇論文所探討的內容與結論吧!

(A)

研究人員使用Roche 454 FLX (V3-V5區) 與 Illumina Miseq (V4區) 對兩個不同群體進行16S定序分析。兩個群體分別為 (1) 8個出生2-11週的早產嬰兒糞便樣品 (微生物組成相對簡單) (2) 6個出生13-19個月的幼兒糞便樣品。針對不同的實驗條件,進行 α 多樣性、β 多樣性等分析比較。


1. 樣品提取條件對微生物的影響

同一樣品經不同實驗人員採用不同批次試劑盒提取後,微生物多樣性無顯著差異。


PCoA_faecal_betaDiversity.png
圖1. PCoA分析 :a. Weighted UniFrac b. Unweighted UniFrac c. Bray-Curtis dissimilarity d. Jaccard dissimilarity. 紅點和藍點表示同一個樣品分為10份,經不同人採用不同批次試劑盒提取後檢測微生物多樣性,分群無顯著差異。其餘橘色、綠色、紫色、黃色表示四個嬰兒樣品在保存不同時間 (2、6、12、18、24個月) 後的微生物多樣性。


2. 樣品提取用量對微生物的影響

一般線性模型分析 (general linear models, GLMs) 分析結果:
α 多樣性與樣品重量無顯著性相關β 多樣性分析中樣品重量也無顯著相關性,分析結果顯示,同一來源 (不同重量) 之間在分群結果更為相似 (圖3)
alpha_diversity_weight.png
圖2. 
α 多樣性與樣品重量間的關係


PCoA_diff_weight.png
圖3. 四個樣品不同重量β 多樣性分析


3. 長期凍存對微生物多樣性的影響

四個多樣性指數與凍存時間之間存在相關性,並且只有observed OTUs隨著凍存時間的增加而減少(p=0.018)。GLMs 分析結果中 β 多樣性與長時間凍存之間無顯著相關性。四個樣品(早產嬰兒5、6、7、8)中,有三個樣品在凍存24個月後weight UniFrac distances偏高,說明這些樣品中微生物豐度發生變化。根據GLMs分析,共發現8種微生物(Lactobacillus 1、Lactobacillus 2、Bacilli、Enterobacteriaceae、Gammaproteobacteria 1、Enterococcus 2、Staphylococcus 1和Staphylococcus 2)發生顯著變化。圖5結果顯示,凍存2個月的樣品中OTUs與其他月數的樣品OTUs相比無顯著差異。


alpha_diversity_storageMonths.png
圖4. α 多樣性與凍存時間的關係


OTUs_storageMonths.png
圖5. 凍存時間與樣品中微生物OTUs的關係


4. 室溫保存對微生物群落結構的影響

α 多樣性指數中,只有Shannon index隨時間顯著降低 (圖6)。在 β 多樣性指數中 (圖7),對於群落結構簡單的樣品 (圖7 i),從第4 hr開始,隨時間延長 unweighted UniFrac distances 增加 (p=0.038),對於群落結構複雜的樣品,所有β 多樣性指數都隨時間延長而增加。


alpha_diversity_room_temperature.png
圖6. 室溫保存時間與微生物α 多樣性
圖7. 室溫保存時間與微生物 β 多樣性的關係


 室溫保存條件下,隨著保存時間的延長,在門層級上,複雜微生物群落(ii)樣品中厚壁菌門顯著降低(p=0.004),變形菌門顯著升高(p=0.018),而放線菌門微生物豐度在兩種不同樣品中都降低(p=0.013和0.033),校正後,只有厚壁菌門微生物豐度存在顯著差異(圖8)。



microbiota_roomTemperature_.png

圖8. 室溫條件下微生物群落結構變化
(i) 簡單微生物群落樣品(早產嬰兒)  (ii)複雜微生物群落樣品(足月生產)


5. 糞便樣品郵寄對微生物的影響

對三組樣品進行比較,1. 
郵寄樣品  2. 室溫下保存4 hr、然後-80℃保存的樣品  3. 一直室溫下保存樣品。其中郵寄樣品和一直室溫下保存樣品 α 多樣性無顯著差異,各OTUs及門層級豐度變化差異不顯著,室溫下4h、然後-80℃保存的樣品與其他兩組樣品 β 多樣性無顯著差異。


(B)

為了評估室溫保存樣品是否會對微生物群落結構造成影響,研究人員共收集了29個健康嬰兒的糞便樣品,並將每個個體樣品分為五等份,使五等份在放置進-80℃保存前存放在室溫下不同的時間長度 (0 min / 16 mins / 30 mins / 1 hr / 2 hrs),並對所有樣品 16S rDNA V3-V5區進行定序。


1. 導致樣本間微生物群落差異的主要因素


基於樣品室溫下儲存時間的分組結果並無差異(圖1 a),而個體樣品間的差異是導致樣品間微生物群落差異的主要因素(圖1 b)。


2. 室溫儲存不同時間嬰兒糞便樣品微生物群落結構的變化

4個室溫儲存組與 t = 0 組比較,t = 15 mins 或 t = 30 mins 組菌群組成變化幅度低於 t = 1 hr 或 t = 2 hrs (圖2)。在部分個體樣本中隨著室溫儲存時間的增加,一些需氧菌或兼性厭氧菌相對豐度升高(圖3上,綠色菌屬),而一些專性厭氧菌相對豐度降低(圖3下,紅色菌屬)。

heatmap_relative_abu_roomT.png

圖2. 所有個體屬階層菌群相對豐度變化倍數Heatmap圖,紅色和綠色分別表示相對豐度增高或降低。


foldchange_roomTemperature.png


根據這兩篇論文的研究結果,小編認為:

1. 不同實驗人員與不同批次試劑盒對微生物多樣性影響不顯著,可不考慮此因素。

2. 目前普遍認為對樣品保存在 -80℃的作法是可以降低微生物群落結構的影響,研究顯示只對Lactobacillus和bacilli等部分微生物構成影響。

3. 室溫下放置超過兩天會對微生物群落產生顯著影響,因此需在兩天內處理,尤其是郵寄運送需考量運輸時間。

4. 樣品若不進行立即處理分析,需凍存於-80℃中以確保微生物群落結構不受影響。

5. 基於群體樣品研究時,室溫儲存時間對於菌群變化影響較小。


圖爾思生物科技 / NGS事業部
郭育倫 文案

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