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二代定序 vs. 三代定序組裝技術大PK

三代Pacbio定序技術以其超長讀長、無需擴增、無GC偏好性等優勢成為 de novo 組裝的新寵兒。然而,Pacbio定序不僅成本非常高且錯誤率也高,這就需要較高的定序深度來修正自身錯誤率,隨著深度的提高成本又會隨之增高。是否有更高性價比的方法得到更好的結果呢?
2vs3 sequencing


一、10X Genomics二代組裝新技術

將Illumina的 short-reads 與 10X Genomics 公司研發的linked-reads相結合,並加上BioNano光學圖譜資訊,組裝得到的 Scaffold 長度達到了媲美三代資料組裝的結果,組裝流程如下圖所示:

10X Genomics_assembly_flowchart

圖1. 10X Genomics資料輔助基因體組裝流程圖[1]


二、技術優勢


1. 超低DNA起始量


表1 Pacbio Library 和 10X Genomics Library 所需DNA量

10X Genomics DNA


2. 低成本,高指標
 
分別利用 Illumina+10X Genomics+BioNano 和 Pacbio+BioNano [2] 兩種策略對人的基因體 NA12878 進行組裝,同時以Illumina+Fosmid-end [3] 組裝策略作為對照。三者組裝的指標見下表。利用Illumina+10X Genomics+BioNano 的策略組裝 Scaffold 最長長度可達99.96Mb,而利用 Pacbio+BioNano 的策略組裝 Scaffold 最長長度為81.4Mb,更長的Scaffold在後續註釋中,能夠得到更完整的基因結構,有助於後續生物學問題的研究。從結果可以看出,前者在組裝 Scaffold 優勢上絲毫不遜於後者。但前者的定序成本卻遠低於 Pacbio+BioNano 的策略。


表2. 不同組裝策略指標比較

different_strategy_assembly.png


Linked-reads.png

圖2. Linked-reads 輔助基因體組裝


3. 高指標,更有高品質

對組裝的基因體進行品質評估,檢測結果如下表所示。首先檢測N(未知鹼基)的含量,在未知鹼基這個指標中顯示了三代定序策略的優勢,說明利用三代長片段定序可有效提高連續序列片段(Contig)長度。同時將組裝的序列分割成以100Kb為單位與參考基因體進行比較來驗證組裝的準確性,可以看到 Illumina+10X Genomics+BioNano 策略組裝的基因體準確性在95%以上,說明該方法組裝品質是高度可信的,並且利用此方法能夠找到更多的SNVs(single-nucleotide variations)。


表3 不同策略組裝基因體組裝質量評估

quality_diff_strategy.png


scaffold_ref.png 
圖3 組裝的Scaffold比對到參考基因體

每個顏色代表一個完整Scaffold,說明組裝的基因體較為完整


綜合比較而言,利用 Pacbio+Bionano 和 Illumina+10X Genomics+Bionano 兩種組裝策略在基因體組裝的Scaffold的長度以及準確性上均有優秀的表現,但是前者的高質量是建立在高成本之下,相比而言,透過二代定序資料,採用新技術組裝策略(Illumina+10X Genomics+Bionano)的後者,無疑是一種更高性價比的選擇。
 

參考文獻

[1] Mostovoy Y, Levy-Sakin M, Lam J, et al . A hybrid approach for de novo human genome sequence assembly and phasing. Nature Methods , 2016.
[2] Pendleton M, Sebra R, Pang AWC, et al . Assembly and diploid architecture of an individual humangenome via single-molecule technologies. Nature Methods , 2015.
[3] Gnerre S, MacCallum I, Przybylski D, et al . High-quality draft assemblies of mammaliangenomes from massively parallel sequence data. Proceedings of the National Academy of Sciences , 2011, 108(4): 1513-1518.


圖爾思生物科技 / 諾禾致源文案

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